¹H-NMR 血清代谢组，比较 ER+ 早期乳腺癌（EBC）与转移性乳腺癌（MBC）的代谢谱，并复现原文用 EBC vs MBC 分类器构建早期患者复发风险评分的思路。数据来自 MetaboLights MTBLS424（国际乳腺癌研究基金会 III 期临床试验血清库）。本项目为其再分析。
标签：metabolomics NMR MetaboLights human breast-cancer recurrence PLS-DA survival random-forest R
| 字段 | 内容 |
|---|---|
| 数据库 | MetaboLights MTBLS424 |
| 物种 | Homo sapiens |
| 平台 | ¹H-NMR 核磁共振谱（靶向定量，22 个已鉴定代谢物） |
| 分组 | EBC（早期，590）vs MBC（转移性，109）；EBC 内含复发随访 |
| 样本 | 血清，699 例，多中心（菲律宾/越南/摩洛哥） |
| 原文 | Hart CD 等, Clin Cancer Res 2017, 23(6):1422-1431. DOI 10.1158/1078-0432.CCR-16-1153 · PMID 28082280 |
数据由 ISA-Tab 三个文本文件构成（MAF 矩阵 + 样本表 + assay 表），全部置于
data/，KB 级，已入库。原始 NMR 谱不需要、不入库。
06_metabolomics-human-breast-serum-MTBLS424/
├── data/ # ISA-Tab 文本（原始谱不入库）
│ ├── m_MTBLS424_..._maf.tsv
│ ├── s_MTBLS424.txt
│ └── a_MTBLS424_...txt
├── scripts/ # _common.R + 00_install + 00–04 + run_all
├── results/
│ ├── figures/ # 每图 .pdf + .png(300ppi)，图内文字一律英文
│ └── tables/ # 矩阵、差异表、VIP、通路、RF重要性、Cox
├── README.md LICENSE .gitignore PROJECT_STATUS.md sessionInfo.txt
00_install_packages.R 依赖安装（仅首次）
_common.R 路径自定位 + 绘图风格 + MAF/样本加载 + 半最小值填补 + 手写 NIPALS PLS-DA/VIP/LOO
00_setup_and_load.R 读 MAF + 样本表 → 代谢物 x 样本矩阵 → 关联 5 个临床因子
01_clean_normalize.R 0→半最小值填补 → 总量归一化 → log2 → QC 图
02_pca_plsda.R PCA（按诊断上色）+ PLS-DA（EBC vs MBC, LOO + VIP）
03_diff_metabolites.R EBC vs MBC 差异代谢物 → 火山/热图/箱线
04_pathway_survival.R 通路富集 + 复发风险评分(RF/ROC) + 生存(KM/Cox)
run_all.R 按编号依次跑 00→04（子进程聚合器）
运行（从项目任意目录，脚本自动定位项目根，按编号逐个跑）：
Rscript scripts/00_install_packages.R # 仅首次
Rscript scripts/00_setup_and_load.R
Rscript scripts/01_clean_normalize.R
Rscript scripts/02_pca_plsda.R
Rscript scripts/03_diff_metabolites.R
Rscript scripts/04_pathway_survival.R
# 或一次跑完: Rscript scripts/run_all.RPLS-DA 为手写 NIPALS 实现，无 ropls/mixOmics 依赖。
数据规模
- MAF：22 个已鉴定代谢物 × 699 样本，NMR 靶向定量，缺失 0%（仅 345 个 0 值，占 2.24%，按半最小值填补）。
- 诊断分组：EBC 590 / MBC 109；早期患者复发 192 / 未复发 398。
整体结构（PCA / PLS-DA）
- PCA：PC1/PC2 未见 EBC、MBC 明显分层（无监督下个体差异主导，符合人血清异质性）。
- PLS-DA（EBC vs MBC，手写 NIPALS，2 成分）：留一交叉验证（LOO）准确率 89.4%，VIP>1 共 10 个代谢物。EBC 与 MBC 沿 LV1 中心明显错开，但置信椭圆有重叠。
差异代谢物（MBC vs EBC，|log2FC|≥log2(1.5) 且 FDR<0.05）
- 共 6 个显著：上调 2（choline log2FC=3.07、acetate），下调 4（D-glucose、citric acid、L-glutamine、D-mannose）。
- 方向符合肿瘤进展代谢特征：转移癌膜代谢活跃（胆碱升高），葡萄糖/谷氨酰胺消耗增强、柠檬酸下降（Warburg 效应 + TCA 重塑）。
通路富集（22 代谢物 panel → KEGG 通路，超几何）
- 12 条通路覆盖，命中显著代谢物的有糖酵解/糖异生、TCA、丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢、果糖-甘露糖代谢、甘油磷脂代谢等。
- p<0.05 富集 0 条：22 代谢物背景太小，超几何检验统计功效弱（如实标注，非生物学阴性）。
复发风险（复现原文"误判为 MBC"思路）
- 原文方法：训练 EBC-vs-MBC 分类器，早期样本被预测为 MBC 的概率 = 复发风险评分。本项目训练锚点 = 长期无复发 EBC（随访≥6 年，209 例）+ 全部 MBC（109 例）；评估 = 不与训练重叠的 held-out 早期患者（192 复发 + 189 短随访未复发）。
- held-out AUC = 0.478，KM log-rank p=0.54，Cox HR=1.47（p=0.33）—— 三者一致表明：22 个已鉴定代谢物在严格无泄漏下对复发几乎无预测力，明显弱于原文 0.747。
诚实说明（重要）：
- 原文复发评分测试集 AUC=0.747，用的是完整 CPMG 谱（数百个谱 bin）；本项目 MAF 只提供 22 个已鉴定代谢物，信息粒度差一个数量级，是 held-out 复发预测接近随机的主因——这是数据可得性限制，非流程 bug。
- 数据泄漏验证：若不隔离训练/评估（把长期无复发锚点也放进评估集），AUC 会虚高到 0.67、KM p=5e-13、Cox HR=15.8。本项目严格 held-out 后回落到随机水平，正是数据泄漏被消除的证据。主分析（EBC vs MBC，LOO 89.4%）是稳健的强结果，复发预测是诚实的弱结果。
- 主分析结果方向（转移癌胆碱升高、糖/谷氨酰胺下降）与乳腺癌进展代谢重塑文献一致。
本项目作为 03 的人类对照，演示"人 vs 非模式物种"代谢组下游差异：
| 维度 | 03 硅藻（非模式） | 06 人血清（本项目） |
|---|---|---|
| 平台 | LC-MS + GC-MS | NMR |
| 元数据 | 盐度 × 时间两因子 | 真临床元数据（诊断/复发/grade/随访） |
| 富集 | 退到化学类别（无 KEGG 注释） | 真 KEGG 通路映射（代谢物注释完整） |
| 下游 | 差异 + 类别富集 | + 生存/复发（RF 风险评分 + ROC + KM + Cox） |
| 语言 | Python + R 双跑 | 单 R |
results/figures/，每图含 .pdf + .png(300ppi)，图内文字一律英文：
| 编号 | 内容 |
|---|---|
| 01 | QC：归一化前后每代谢物分布箱线、样本总强度对比 |
| 02 | PCA 得分（按诊断）、Scree、PLS-DA 得分（标 LOO 89.4%） |
| 03 | 火山图、显著代谢物 z-score 热图、top 代谢物分组箱线 |
| 04 | 通路富集条形、复发风险 ROC（held-out）、RF 代谢物重要性、高/低危 KM 生存曲线 |
R 4.4.2：dplyr, tidyr, ggplot2, ggrepel, pheatmap, RColorBrewer, pROC, survival, survminer, randomForest
图内文字一律英文，theme_pub_bw() 用 sans 字体，无需中文字体。sessionInfo.txt 记录完整版本。
Hart CD, Vignoli A, Tenori L, et al. Serum Metabolomic Profiles Identify ER-Positive Early Breast Cancer Patients at Increased Risk of Disease Recurrence in a Multicenter Population. Clin Cancer Res 2017;23(6):1422-1431. https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-16-1153